Nach einiger Zeit sagte Paulus zu Barnabas: Wir wollen wieder aufbrechen und sehen, wie es den Brüdern in all den Städten geht, in denen wir das Wort des Herrn verkündet haben. Barnabas wollte auch den Johannes, genannt Markus, mitnehmen; doch Paulus bestand darauf, ihn nicht mitzunehmen, weil er sie in Pamphylien im Stich gelassen hatte, nicht mit ihnen gezogen war und an ihrer Arbeit nicht mehr teilgenommen hatte.
Es kam zu einer heftigen Auseinandersetzung, sodass sie sich voneinander trennten; Barnabas nahm Markus mit und segelte nach Zypern. Paulus aber wählte sich Silas und reiste ab, nachdem die Brüder ihn der Gnade des Herrn empfohlen hatten. Er zog durch Syrien und Kilikien und stärkte die Gemeinden. (Apg 15,36-41)
Die zweite Missionsreise des Apostels Paulus beginnt mit einem Streit. Paulus trennt sich von Barnabas, der ihn auf der ersten Reise begleitet hat. Die genauen Hintergründe lassen sich nicht mehr nachvollziehen. Paulus hat, was die Überlieferung betrifft, eindeutig die besseren Karten, die Spur des Barnabas verliert sich im Nebel der Geschichte. Vielleicht stand Paulus damals nicht so klar im Vordergrund, wie wir es heute sehen. War Paulus hier zunächst der Unterlegene? Er wird jedenfalls nie mehr nach Antiochien, wo der Streit stattfand, zurückkehren. Mit Silas bekommt Paulus nun ein herausragendes Mitglied der Jerusalemer Gemeinde zum Begleiter.
Er kam auch nach Derbe und nach Lystra. Und siehe, dort lebte ein Jünger namens Timotheus, der Sohn einer gläubig gewordenen Jüdin und eines Griechen. Er war Paulus von den Brüdern in Lystra und Ikonion empfohlen worden. Paulus wollte ihn als Begleiter mitnehmen und ließ ihn mit Rücksicht auf die Juden, die in jenen Gegenden wohnten, beschneiden; denn alle wussten, dass sein Vater ein Grieche war.
Als sie nun durch die Städte zogen, überbrachten sie ihnen die von den Aposteln und den Ältesten in Jerusalem gefassten Beschlüsse und trugen ihnen auf, sich daran zu halten. So wurden die Gemeinden im Glauben gestärkt und wuchsen von Tag zu Tag.
Weil ihnen aber vom Heiligen Geist verwehrt wurde, das Wort in der Provinz Asien zu verkünden, reisten sie durch Phrygien und das galatische Land. Sie zogen an Mysien entlang und versuchten, Bithynien zu erreichen; doch auch das erlaubte ihnen der Geist Jesu nicht. So durchwanderten sie Mysien und kamen nach Troas hinab. Dort hatte Paulus in der Nacht eine Vision. Ein Mazedonier stand da und bat ihn: Komm herüber nach Mazedonien und hilf uns! Auf diese Vision hin wollten wir sofort nach Mazedonien abfahren; denn wir kamen zu dem Schluss, dass uns Gott dazu berufen hatte, dort das Evangelium zu verkünden. (Apg 16,1-10)
Zunächst besuchte Paulus bekannte Gemeinden und übermittelte ihnen die Beschlüsse des Apostelkonzils von Jerusalem. Hierbei kam es zur Begegnung mit Timotheus, der zu einem der wichtigsten Mitarbeiter des Paulus werden wird. Nachdem Paulus zunächst in Kleinasien weiter missionieren wollte, dabei aber auf nicht näher benannte Hindernisse stieß, erhielt er in einer nächtlichen Vision den Ruf, nach Europa überzusetzen.